Bazy sekwencji DNA, GenBank

Czym jest GenBank?

GenBank jest jedną z baz The National Center for Biotechnology Information (NCBI) gromadzącą i udostępniającą publicznie sekwencje DNA. W ramach International Nucleotide Sequence Database Collaboration współpracuje z DNA DataBank of Japan (DDBJ) oraz European Nucleotide Archive (ENA) z którymi regularnie wymienia dane. Zachęcam do odwiedzenia i sprawdzenia możliwości pozostałych dwu baz danych, jednak na naszych zajęciach zajmiemy się bazą GenBank.

Najpierw pokażę podstawy pobierania sekwencji DNA przez stronę internetową GenBank-u, później zaprezentuję kilka sposobów pobierania danych z linii komend.

Proste wyszukiwanie danych z bazy GenBank przez stronę WWW

W przeglądarce internetowej wejdź na stronę https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank. Pokaże się strona początkowa z paskiem wyszukiwania u góry:

Strona startowa GenBank

Po lewej stronie paska wyszukiwania, znajduje się rozwijane menu, gdzie można wybrać bazę danych NCBI, z której chcemy korzystać.

Bazy NCBI

Jak widać jest ich wiele, m. in. baza zawierająca sekwencje proteinowe czy baza taksonomiczna. Nas teraz interesuje ,,Nucleotide'', która odpowiada bazie GenBank.

Wpisz w pasku wyszukiwania atp6 i kliknij ,,Search''.

Po chwili pokazuje się okno z wynikami wyszukiwania:

Wyniki wyszukiwania

Poniżej paska wyszukiwania, strona jest podzielona na trzy kolumny. Oprócz samych wyników wyszukiwania w kolumnie środkowej, na stronie widzimy wiele dodatkowych informacji a także dodatkowych narzędzi. Krótko omówię niektóre z nich.

Na górze środkowego panelu mamy możliwość zmiany sposobu wyświetlania wyników a także eksportu pliku np. do pliku czy schowka.

Środkowy panel - góra

Na przykład zmieniając sposób wyświetlania ,,Summary'' na ,,FASTA''...

Zmiana formatu wyników

... uzyskujemy w wynikach podgląd sekwencji w formacie FASTA.

Wyniki w formacie FASTA

Wyniki (wszystkie lub wybrane przez zaznaczenie odpowiednich rekordów) można skopiować do schowka na stronie (tu są pewne limity), dodać do kolekcji na swoim koncie albo zachować w pliku o wybranym formacie, np. FASTA:

Eksport wyników

Poniżej znajduje się ramka z pełniejszą nazwą sekwencji i linkiem do informacji o niej.

Przyjrzyjmy się teraz jak wygląda pojedynczy rekord wyświetlany w formacie domyślnym - ,,Summary'':

Rekord

Na górze znajduje się opis sekwencji, który jest linkiem do szczegółowych informacji wyświetlanych w formacie GenBank. Następna linia informuje o długości i rodzaju sekwencji. Następnie widać numer dostępowy (,,Accession''), który jest unikalnym numerem danej sekwencji. Po tym numerze można ją jednoznacznie zidentyfikować, toteż zazwyczaj podaje się go w publikacjach, drzewach filogenetycznych itp. Drugi z podanych numerów (,,GI'') jest numerem identyfikacyjnym GenBank i ma mniejsze znaczenie z naszego punktu widzenia.

W kolejnej linii wyświetlone są odsyłacze do innych baz, można dzięki nim sprawdzić sekwencję aminokwasów dla danego genu (,,Protein''), zobaczyć powiązaną publikację (,,PubMed'') czy poznać pozycję systematyczną organizmu (,,Taxonomy'').

Na dole umieszczone są linki, które pozwalają wyświetlić wynik w formacie GenBank i FASTA, w sposób graficzny i w końcu (,,PopSet'') wyświetlić listę sekwencji, które były wysłane do GenBank-u razem z daną sekwencją a więc są na ogół w jakiś sposób z nią powiązane.

W lewym panelu znajdują się informacje na temat liczby znalezionych sekwencji w różnych kategoriach, wydzielonych na podstawie grupy organizmów (,,Species''), rodzaju cząsteczek (,,Molecule types''), źródła danych (,,Source databases'') czy rodzaju genomu (,,Genetic compartments''). Klikając na odpowiednie kategorie można zawęzić wyniki np. do roślin czy genomów mitochondrialnych. Można kategorie łączyć. Na przykład klikając w ,,Plants'' i ,,Mitochondrion'' otrzymujemy wyniki dla roślinnych sekwencji mitochondrialnych.

Sekwencje roślinne, mitochondrialne

Na dole lewego panelu można także zawęzić wyszukiwanie sekwencji do konkretnego zakresu długości sekwencji, czasu publikacji czy daty aktualizacji. Najbardziej przydatna wydaje się być pierwsza możliwość, pozwala wyeliminować zbyt krótkie sekwencje.

Wybór zakresu długości sekwencji

Teraz przenieśmy się na prawy panel. Przy zawężonym zakresie wyszukiwania teraz wygląda tak (porównaj z poprzednim wyglądem):

Prawy panel

Sekcja ,,Results by taxon'' pokazuje organizmy o największej liczbie wyników. Klikając na ,,Tree'' otrzymujemy widok drzewa.

Widok drzewa

Klikając na odpowiednie pozycje możemy zawęzić wyniki do określonej grupy organizmów, drzewo można także rozwijać do mniejszych jednostek taksonomicznych.

Teraz przejdźmy nieco niżej do sekcji ,,Search details''. Tam w okienku widzimy w formie tekstowej treść naszego zapytania, razem z ustawionymi filtrami ograniczającymi zakres wyszukiwania. Zauważ, że w parach nawiasów kwadratowych znajdują się nazwy pól wyszukiwania, tak więc np. atp6 wyszukiwane jest we wszystkich polach a plants i mitochondrion w polu Filter, ograniczenie do grupy organizmów można uzyskać używając pola porgn. Jeśli zechcesz się pokusić o ręczne wpisywanie zapytań (lub ich części) to warto zapoznać się ze znaczeniem nazw pól, które można znaleźć w dokumentacji pod adresem https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK49540/. Warto też zwracać uwagę jak zmienia się tekst zapytania w zależności od zmian w ustawianych filtrach. Poszczególne części zapytania można łączyć za pomocą operatorów AND, OR oraz NOT a także grupować za pomocą nawiasów.

Zapytanie można oczywiście wpisywać także w pasek wyszukiwania u góry strony. Warto też obserwować jak zmienia się treść zapytania w polu ,,Search details'' w zależności od tego co wpisujemy w pasek wyszukiwania.

Na przykład wpisując w pasku wyszukiwania atp6 Orobanche widzimy w okienku ,,Search details'' zapytanie: atp6[All Fields] AND ("Orobanche"[Organism] OR Orobanche[All Fields]). Operator AND oznacza, że oba łączone nim wyrażenia powinny być spełnione. Jak widać, jest to domyślny operator wyszukiwania. Zauważ też, że słowo Orobanche jest wyszukiwane nie tylko w polu Organism (które oczywiście oznacza konkretny organizm) ale we wszystkich polach danego rekordu, co może tłumaczyć dlaczego w wynikach widzimy także sekwencje innych gatunków.

Teraz wpisz zapytanie: atp6[All Fields] AND "Orobanche"[Organism] i sprawdź jakie będą wyniki.

Jeśli chcemy wykluczyć część wyników, użyjemy operatora NOT. Zapytanie atp6[All Fields] NOT "Orobanche"[Organism] zwróci sekwencje atp6 nienależące do Orobanche.

Działanie ostatniego z operatorów OR pokażę na przykładzie, razem z zastosowaniem nawiasów. Zapytanie atp6[All Fields] AND ("Orobanche"[Organism] OR "Phelipanche"[Organism]) pozwoli znaleźć sekwencje atp6 należące do Orobanche lub Phelipanche. Otrzymamy więc sekwencje roślin należących do obu rodzajów.

Na dole prawego panelu znajdziemy linki do poprzednich wyszukiwań.

Przy wyszukiwaniu danych w GenBank-u należy pamiętać o tym, że w przeciwieństwie do popularnych wyszukiwarek internetowych, które tolerują literówki tu trzeba być bardzo dokładnym, nie otrzymamy pomocy w postaci linku ,,Czy chodziło Ci o....?".

Poniżej pasku wyszukiwania na górze znajduje się link Advanced. Jak można się domyślić, znajdziemy tam narzędzie pozwalające tworzyć złożone i/lub precyzyjne zapytania:

Tworzenie złożonych i precyzyjnych zapytań

Jeśli znasz numer GenBank-u szukanej sekwencji to dobrym pomysłem jest wpisanie go (zamiast gatunku i nazwy sekwencji) do paska wyszukiwań. Wtedy, jeśli numer jest prawidłowy od razu przejdziesz do strony z wynikiem, tej samej, którą otworzysz klikając w wynik wyszukiwania.

Wpisz numer KU180474.

Sekwencja - informacje i pobieranie

Strona z wynikiem składa się z dwu paneli (pomijając pasek wyszukiwania). W prawym znajdują się narzędzia, które teraz pominiemy, choć do niektórych jeszcze wrócimy. Przeanalizujmy panel lewy z informacjami dotyczącymi sekwencji.

Na górze znajduje się nagłówek z opisem sekwencji, numerem GenBank i linkami, które już omawialiśmy przy okazji listy wyników wyszukiwania.

Wynik - nagłówek

Poniżej znajduje się sekcja z polami opisującymi ogólnie sekwencje. Odpowiadają one polom używanym w trakcie wyszukiwania. W zasadzie nie wymagają one wyjaśnienia. Warto zwrócić uwagę, że często można znaleźć tam nazwę artykułu w którym opublikowano badania dotyczące sekwencji. Trzeba jednak uważać - autorzy wprowadzają do bazy sekwencje zwykle przed opublikowaniem artykułu, jest to więc zazwyczaj tytuł roboczy. Co prawda po ukazaniu się publikacji powinni dane zaktualizować, ale nie zawsze tak się dzieje.

Wynik - opis sekwencji

Następne pole FEATURES zawiera kolejne pola dokładniej opisujące sekwencje, łącznie z genami i innymi specyficznymi fragmentami DNA, miejscami kodującymi i translacją sekwencji. Jest ona zwłaszcza przydatna, gdy chcemy pobrać jedynie część sekwencji. Sekwencja nie musi bowiem odpowiadać jednemu genowi - może to być np. genom mitochondrialny czy sekwencja całego chromosomu. Wtedy możemy chcieć np wyciąć z niej jeden gen. Wrócimy jeszcze do tego tematu.

Wynik - szczegóły sekwencji

Dalej znajduje się sekwencja nukleotydów, czyli to czego zazwyczaj szukamy w GenBank-u.

Wynik - sekwencja nukleotydów

Mogłoby się wydawać, że teraz można zaznaczyć fragment z sekwencją nukleotydów, skopiować i wkleić do edytora tekstu aby po uzupełnieniu linii z opisem sekwencji (zaczynającej się od znaku >) otrzymać plik FASTA. Można, ale nie jest to najlepszy pomysł. Przede wszystkim ze względu na to, że skopiowany tekst zawiera numery i spacje, które trzeba by usunąć. Jak zatem otrzymać sekwencje w formacie FASTA? Na górze strony znajdują się linki FASTA oraz Send to. Po kliknięciu pierwszego z nich uzyskujemy stronę z wynikiem w tym właśnie formacie, który można skopiować i wkleić do edytora tekstu, łącznie z linią opisu sekwencji.

Wynik w formacie FASTA

Klikając w Send to otwiera się okienko, które pozwala m. in. zapisać sekwencję do pliku FASTA (patrz wyżej).

Dużo dokładniejszy opis poszczególnych pól opisujących sekwencję można znaleźć w dokumentacji GenBank-u pod adresem https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html.

Zadanie

Utwórz plik atp6.fasta w którym umieść następujące sekwencje:

Artemisia campestris KU180471
Centaurea scabiosa KU180476
Helianthus annuus FJ595983
Magnolia stellata KC879635
Mimulus guttatus HQ593782
Orobanche alba KU180469
Orobanche grenieri KU180474
Peucedanum cervaria KU180475
Phelipanche purpurea KU180468
Phelipanche ramosa KU180466
Solanum tuberosum AF095276

Pobieranie sekwencji genu z genomu

Dotychczas wyszukiwaliśmy sekwencje, które zostały umieszczone w GenBank-u jako oddzielne sekwencje genów. Nie zawsze jednak sytuacja jest tak wygodna. W wielu przypadkach sekwencje genów są częścią dużo dłuższych odcinków DNA, na przykład chromosomów, genomów plastydowych czy mitochondrialnych. Pokażę teraz jak z nich wydobyć interesujące nas sekwencje.

Wyszukaj w GenBank-u sekwencję 'NC_001284'. Pokaże się taki wynik:

Sekwencja genomu mitochondrialnego

Jak widać z opisu oraz informacji poniżej znaleźliśmy sekwencję genomu mitochondrialnego Arabidopsis thaliana. Teraz wyszukajmy w niej sekwencję genu cox3. W tym celu w sekcji FEATURES należy znaleźć pole gene z wartością \gene="cox3". Ponieważ liczba opisanych sekwencji jest bardzo długa, nie ma sensu przeglądać całości w poszukiwaniu żądanego genu.

Jednym ze sposobów znalezienia go jest użycie wbudowanej w wyszukiwarce internetowej wyszukiwarce tekstu, wywoływanej skrótem . W okienku wpisujemy cox3 i szukamy odpowiedniej części wyniku.

Gen w genomie

Pole gene odnosi się do regionu oznaczonego jako gen, niekoniecznie zawierający wyłącznie miejsca kodujące. Te są opisane w części oznaczonej jako CDS (coding sequence).

Przy gene mamy podany zakres odcinka 217631..217639, dla CDS jest to 218280..219077. Mamy też podane inne, dotyczące genu informacje jak miejsce zajmowane przez promotor czy miejsca edycji RNA. Dla CDS jest także pokazana sekwencja aminokwasów.

Kliknij teraz na gene.

Fragment `gene`

Pokazuje się, zaznaczony na brązowo, fragment genomu mitochondrialnego odpowiadający żądanej sekwencji. Na dole pojawia się także pasek nawigacyjny pomiędzy cechami (Features), ,,dymek'' z różnymi informacjami a także linki umożliwiające wyświetlenie sekwencji w odpowiednim formacie, w tym FASTA.

Jeśli zamiast gene klikniemy CDS otrzymamy podobny wynik, ale z informacjami charakterystycznymi dla sekwencji kodującej:

Fragment `CDS`

Po kliknięciu w link FASTA na dole ekranu pojawia się sekwencja w formacie FASTA.

Fragment `CDS` w formacie FASTA

Podobny widok widzieliśmy wcześniej ale zwróć uwagę, ze po prawej znajduje się okienko, w którym znajdują się edytowalne pola z zakresem wyświetlanej sekwencji. Czasem chcemy pobrać nieco dłuższy (lub krótszy) fragment niż wyświetlany domyślnie, wtedy można zmienić numery i kliknąć Update View. Wyświetli się zmodyfikowany zakres nici DNA.

Fragment `CDS` w formacie FASTA - poszerzony zakres

Sekwencję można pobrać tak jak opisywałem poprzednio.

Sekwencje komplementarne

Czasem przy opisie sekwencji znajdujemy informację, że jest ona komplementarna (complement), co oznacza, że znajduje się ona na nici komplementarnej. Znajdź gen rpl16.

Sekwencja na nici komplementarnej

Taka sekwencja przy dopasowaniu do innych powinna być przekształcona w sekwencję odwróconą komplementarną. Na szczęście jeśli wyświetlimy ten fragment w formacie FASTA otrzymamy od razu sekwencję w odpowiedniej formie. Zauważ, że zakres sekwencji jest podany w odwrotnej kolejności:

Sekwencja odwrócona komplementarna

Sekwencje we fragmentach

Znajdź teraz gen nad2.

Gen we fragmentach

Zauważ, że przy opisie genu znajduje się nie tylko informacja, że jest ona komplementarna ale, że aby uzyskać sekwencję genu (lub CDS) trzeba połączyć kilka fragmentów (join). Czasem niektóre fragmenty są komplementarne inne nie, mogą też pochodzić z różnych sekwencji w bazie (np. rożnych chromosomów). Sprawdź na przykład gen nad1 w sekwencji KF754803. Kompletna, złożona sekwencja powinna pokazać się po kliknięciu linku FASTA w lewym dolnym rogu, ale nie zawsze to działa. W takim wypadku można po kolei wyświetlać kolejne fragmenty genomu w formacie FASTA (jak pokazałem powyżej) a następnie je łączyć w edytorze tekstu lub programie do obróbki sekwencji. Jeśli sekwencja jest komplementarna, jak w przypadku nad2, trzeba będzie ją zmienić na odwróconą, komplementarną. Łączenie fragmentów może być nużące, jest to jeden z przypadków, w których wygodniejsze może być użycie narzędzi działających w linii komend.